食物中硒的測(cè)定

熒光法
1. 原理
樣品經(jīng)混合酸消化后，硒化合物被氧化為四價(jià)無(wú)機(jī)硒（Se4+）,與2，3二氨基萘（2,3-diaminonaphthalene,簡(jiǎn)稱為DAN）反應(yīng)生成4，5－苯丙丕硒腦（4,5-benzopiaselennol）,其熒光強(qiáng)度與硒的濃度在一定的條件下成正比。用環(huán)己烷萃取后于激發(fā)光波長(zhǎng)376nm,發(fā)射光波長(zhǎng)520nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度與繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。本方法檢出限為3ng。
2. 方法來(lái)源
GB/T 12399 -1996，本方法是測(cè)定食物中微量元素硒的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。
3． 儀器和設(shè)備
1) 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備
2) 熒光分光光度計(jì)
4. 試劑
除說(shuō)明外均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。
4.1 環(huán)己烷
4.2 硝酸
4.3 過(guò)氯酸
4.4 鹽酸
4.5 氫溴酸
4.6 （1＋9）鹽酸溶液
4.7 (1+1)氨水
4.8 (5+95) 去硒硫酸：取5ml去硒硫酸，加入95ml水中。
去硒硫酸：取200ml硫酸，加于200ml水中，再加30ml氫溴酸，混勻，置沙浴上加熱蒸去硒與水至出現(xiàn)濃白煙，此時(shí)體積應(yīng)為200ml。
4.9 0.2 mol/L EDTA: 將37g EDTA二鈉鹽，加水并加熱溶解，冷卻后稀釋至500ml。
4.10 10% 鹽酸羥胺：稱取10g鹽酸羥胺溶于水中，稀釋至100ml。
4.11 混合酸：硝酸＋過(guò)氯酸（2＋1）
4.12 0.1% 2,3-二氨基萘（純度為95～98%）： 需在暗室配制，稱取200mgDAN于一帶蓋三角瓶中，加入200mL0.1mol/L鹽酸，振搖約15min，使其全部溶解，約加40mL環(huán)己烷，繼續(xù)振搖5 min ,將此液體轉(zhuǎn)入分液漏斗中，待溶液分層后，棄去環(huán)己烷層，收集DAN層溶液。如此用環(huán)己烷純化DAN直至環(huán)己烷中的熒光數(shù)值降至*低時(shí)為止（純化次數(shù)視DAN純度不同而定，一般約需純化3－4次）。將提純后的DAN溶液儲(chǔ)于棕色瓶中，約加1㎝厚的環(huán)己烷覆蓋溶液表面。置冰箱中保存。必要時(shí)再純化一次。
4.13 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液
A) 硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/mL）： **稱取100.0mg元素硒（光譜純），溶于少量硝酸中，加2mL過(guò)氯酸，置沸水浴中加熱3－4h，冷卻后加入8.4mL鹽酸，再置沸水浴中煮2min。準(zhǔn)確稀釋至1000mL，其鹽酸濃度為0.1mol/L。此儲(chǔ)備液濃度為100μg/mL。
B) 硒標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.05μg/mL）：將4.13.1液用0.1mol/L鹽酸稀釋，使含硒為0.05μg/mL。于冰箱中保存。
4.14 0.02％甲酚紅指示劑：稱取50mg甲酚紅溶于水中，加（1＋1）氨水1滴，待甲酚紅完全溶解后加水稀釋至250mL。
4.15 EDTA混合液：取0.2mol/L的EDTA（4.9）和10％鹽酸羥氨（4.10）液各50mL，混勻，再加5mL（4.14）溶液，用水稀釋至1L。
5. 分析步驟
5.1 樣品處理及消化
1) 糧食：樣品用水洗三次，于60℃烘干，用不銹鋼磨磨成粉，儲(chǔ)于塑料瓶?jī)?nèi)，放一小包樟腦精，蓋緊蓋保存，備用。
2) 蔬菜及其他植物性食物：取可食部分用水沖洗三次后用紗布吸去水滴，用不銹鋼刀切碎，取混合均勻的樣品于60℃烘干，稱重，粉碎，備用。
3) 稱取0.5－2.0g樣品（含硒量0.01－0.5μg）于磨口三角瓶?jī)?nèi)，加10mL（5＋95）去硒硫酸，樣品潤(rùn)濕后，再加20mL混合酸液放置過(guò)夜。次日于沙浴上逐漸加熱，當(dāng)激烈反應(yīng)后（溶液變無(wú)色），繼續(xù)加熱至產(chǎn)生白煙，溶液逐漸變成淡黃色即達(dá)到終點(diǎn)。某些蔬菜樣品消化后常出現(xiàn)渾濁，難以確定終點(diǎn)，所以要細(xì)心觀察。另外，含硒較高的蔬菜含有較多的Se6+，需要在消化達(dá)到終點(diǎn)時(shí)冷卻后加10mL（1＋9）鹽酸，繼續(xù)加熱，使Se6+還原成Se4+。同樣按上述方法確定終點(diǎn)。
5.2 測(cè)定
于樣品消化液中加20mLEDTA混合液，用氨水（1＋1）或鹽酸調(diào)至淡紅橙色（pH 1.5～2.0）。以下步驟在暗室進(jìn)行：加3 mLDAN試劑，混勻，置沸水浴中煮5min，取出立即冷卻，加3mL環(huán)己烷，振搖4min，將全部溶液移入分液漏斗，待分層后棄去水層，環(huán)己烷層轉(zhuǎn)入帶蓋試管中，小心勿使環(huán)己烷中混入水滴，于激發(fā)光波長(zhǎng)376，發(fā)射光波長(zhǎng)520nm處測(cè)定丕硒腦的熒光強(qiáng)度。
5.3 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確吸收硒標(biāo)準(zhǔn)使用液0，0.2，1.0，2.0及4.0mL加水至5mL，按樣品測(cè)定步驟同時(shí)進(jìn)行。硒含量在0.5μg以下時(shí)熒光強(qiáng)度與硒含量呈線性關(guān)系，在常規(guī)測(cè)定樣品時(shí)，每次需做試劑空白與樣品硒含量相近的標(biāo)準(zhǔn)管（雙份）即可。
6．結(jié)果

式中：X--樣品中硒含量，μg/g；
A--標(biāo)準(zhǔn)管熒光讀數(shù)；
B--空白管熒光讀數(shù)；
C--樣品管熒光讀數(shù)；
m1--標(biāo)準(zhǔn)管中硒質(zhì)量，μg；
m2--試樣質(zhì)量，g。
7．注意事項(xiàng)
7.1 結(jié)果的允許差：同一實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定或重復(fù)測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差**值≤10％。
7.2硒含量在0.5μg以下熒光強(qiáng)度與硒含量呈線性關(guān)系，超過(guò)0.5μg時(shí)為非線性關(guān)系，故硒含量應(yīng)控制在0.5μg以內(nèi)。硒含量過(guò)高時(shí)要先用環(huán)己烷稀釋樣品，再測(cè)定熒光。
7.3我國(guó)高硒地區(qū)食物樣品中的硒，多以Se6+形式存在，故應(yīng)在消化到終點(diǎn)后，加（1＋9）HCl還原后繼續(xù)消化至終點(diǎn)再測(cè)定。